加入日期：2018.10.22 瀏覽次數(shù)：77359次
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| WB實驗中化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)的使用 一般的WB檢測過程中，都會有膜的封閉、一抗孵育、二抗孵育和底物顯色這四道“加工”工序。最后的底物顯色是最關(guān)鍵的一部，也是最有文章可作的一個部分。 WB顯色的方法主要有放射自顯影、底物化學(xué)發(fā)光ECL、底物熒光ECF和底物DAB呈色四種方法，發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL，操作比較簡單，只需要購買現(xiàn)成的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒即可。試劑盒中一般使用的反應(yīng)底物A和B分別是魯米諾(又名發(fā)光氨) 和過氧化氫，原理如下(二抗用HRP標記)：在HRP的催化作用下，魯米諾與過氧化氫反應(yīng)生成一種過氧化物，過氧化物不穩(wěn)定隨即分解，形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體，當后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)，就會產(chǎn)生熒光，可用X膠片和成像設(shè)備進行檢測。使用傳統(tǒng)的X膠片顯影方法進行WB實驗時，最后需要使用暗室曝光來進行ECL檢測，但是建造暗室浪費空間，在暗室中曝光步驟繁瑣，沖洗X光片時會接觸有毒的化學(xué)藥劑?；瘜W(xué)發(fā)光成像設(shè)備能夠?qū)CL發(fā)光直接成像，獲得實驗結(jié)果，避免暗室曝光的不便。 是否能夠拍攝到ECL的圖像主要取決于設(shè)備是不是帶有制冷的CCD，只有制冷的CCD才夠靈敏地捕捉到膜上發(fā)出的光。隨著Cooled-CCD技術(shù)的發(fā)展，成像系統(tǒng)成本越來越低，因而在現(xiàn)在的實驗室里這些設(shè)備越來越普遍。本實驗室目前采用的是化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，具有靈敏度高，成像速度快、成像效果清晰等優(yōu)點。 該儀器的使用非常簡單： 1）在使用前開機預(yù)冷，待儀器溫度降到-20℃才可以進行檢測； 2）將化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒中的A和B按照1:1混合； 3）PVDF膜正面朝上放于暗箱，用移液槍將發(fā)光液均勻地涂在膜上，關(guān)閉暗箱箱門，進行曝光； 4）曝光可以自動曝光，也可手動曝光，一般先點擊自動曝光，觀察成像效果，若不理想可再手動調(diào)節(jié)曝光時間； 另外該儀器還具有多張拍攝模式，可將一張膜在不同的曝光時間下連拍6張，使曝光更方便。 內(nèi)參一般顯影15s（影像條帶粗細深淺一致說明內(nèi)參已調(diào)齊），內(nèi)參好說明各步實驗操作均無誤，即可進行后續(xù)的目的蛋白檢測，目的蛋白結(jié)果的好壞就取決于其表達量以及抗體的特異性和效價了。 與X膠片相比，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)具有瞬時影像處理、立即輸出、不需要膠片處理裝置及暗室等成本花費、可用軟件半定量分析等優(yōu)點，因而在現(xiàn)在的實驗室里化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)的使用已經(jīng)逐漸取代傳統(tǒng)的暗室壓片曝光檢測。 | |
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